子羊胎児の左心流量の減少は左心低形成を引き起こし、左心不全を引き起こす

Communications Biology volume 6、記事番号: 770 (2023) この記事を引用

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胎児の左心における血流低下は、左心形成不全症候群 (HLHS) の病因として推測されることがよくあります。左心流量の減少が成長不全を引き起こすかどうかを調べるために、超音波ガイド下の経皮技術を使用して左心房にコイルを埋め込み、妊娠中期の子羊の胎児に左心室流入閉塞（LVIO）を生成させます。重要なLVIOは、HLHSの重要な臨床的特徴を再現しています：順行性大動脈弁流量の減少、動脈管からの脳および上行大動脈（AAo）の代償性逆行性灌流、重度の左心低形成、非心尖形成LV、および肥厚した心内膜層。低形成性 AAo は、バルク RNA 配列によって逆に差次的に発現される、細胞増殖に注釈を付ける miRNA 遺伝子ペアを持っています。低形成性 LV 心筋の単核 RNA シーケンスでは、心筋細胞核の割合の相反的な減少と線維芽細胞の増加が示されています。低形成心筋の線維芽細胞、心筋細胞および内皮細胞では、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達が調節不全に陥り、細胞外マトリックス成分または線維症遺伝子の発現が増加しています。したがって、胎児の左心流量の重度の持続的（妊娠 1/3 まで）の減少は、左心低形成を引き起こすのに十分です。これには、線維化促進環境および間葉プログラムの異常な誘導と一致する細胞組成および遺伝子発現の変化が伴います。

左心室 (LV) 低形成は、多くの形態の先天性心疾患の構成要素です。最も重度の症状である左心形成不全症候群（HLHS）では、左心構造がすべて小さくなり、全身循環を支えることができなくなります。再建手術にもかかわらず、HLHS の臨床転帰は最適とは言えません。手術の種類に応じて、1 年生存率は 64% または 74%1、6 年生存率は 59% または 64%2 です。 HLHS 患者のうち 18 歳に達するのはわずか約 50% であり、成人早期までに心不全などの複数の課題に直面します3。

左室低形成の病因は依然として不確実であり、不均一である可能性が高い。一部の胎児では、心臓形成の完了後に左室低形成が明らかになる場合があり、これは妊娠 9.1 週 (カーネギー期 22) での心室中隔の閉鎖によって特徴づけられます。 HLHS の特定の状況では、心臓形成後の LV 成長不全の発症は、無傷の心室中隔が HLHS の最も一般的な解剖学的パターン (大動脈弁および/または僧帽弁の狭窄または閉鎖) で見られるという観察によって裏付けられています4。また、重度の胎児大動脈弁狭窄症が HLHS に進行することは、妊娠第 2 期または第 3 期に繰り返し報告されています 7。心室中隔の閉鎖による血行力学的影響は、胎児の左室充満がより不安定になることです。左房心室弁を通過する流れに完全に依存しており、心室中隔を通過する流れによって補うことはできなくなります。

血行力学的な力が HLHS の病因に役割を果たすと仮説が立てられ、動物モデルは血流が心血管構造の発達と成長に影響を与えることを実証しました。ウサギの頸動脈の流れが 2 週間で 70% 減少すると、内皮依存的に直径が減少し、血管拡張に耐性が生じました 8。ゼブラフィッシュの胚では、心室流入または流出の閉塞が、弁形成や心室分化などの心臓の形態形成に重大な影響を及ぼしました。遠位側の成長不全は、心内膜細胞に対するせん断力の低下に起因すると考えられました9。ニワトリの初期胚では、片側卵黄静脈結紮により咽頭弓動脈と心臓の構造奇形が生じました10、11、12。結果として生じる心臓欠陥、最も一般的には心室中隔または半月弁の異常は、流量減少の程度に依存します13。心臓形成後の年長のニワトリの胚では、左心臓の流入障害により心臓の成長が低下しました14。

0.88 for AAo and >0.91 for LV). We also noticed between-sample variation, which may outweigh effects from the coiling for some samples (Fig. S6) and may be related to some samples having low RNA integrity numbers (RIN). After removing outliers, we identified 64 significantly upregulated, and 85 downregulated genes in AAo (Figure S7a; upregulation refers to higher expression in coiled fetuses). Pathway analyses of significantly differentially expressed genes revealed enrichment for cellular components of the cell periphery (p = 0.022) and plasma membrane (p = 0.029; Supplementary Data 1). Additionally, we identified 4 upregulated miRNAs in AAo (Fig. S8a). For three of those miRNAs, we found significantly downregulated target genes (Fig. S8b), including genes involved in cell growth and proliferation (DDIT4, HS6ST2) and cell adhesion (NRXN3, IGFS3, HS6ST2). For the LV, we discovered 4 significantly upregulated, and 13 downregulated genes (Fig. S7b), enriched for brown fat cell differentiation processes. We also identified 4 upregulated and 7 downregulated miRNAs (Fig. S9a). Among the top upregulated miRNAs was miR-15a-5p. In mice, overexpression of miR‐15 family members was associated with cardiomyocyte cell cycle withdrawal and smaller heart size33. Two upregulated miRNAs had significantly downregulated target genes, and three downregulated miRNAs had significantly upregulated target genes (Fig. S9b). Additional “novel” miRNAs in AAo and LV could not be matched with their respective orthologues and were therefore not evaluated. While the low RIN values necessitate cautious interpretations, we found differentially expressed miRNAs and target genes associated with cell growth, proliferation and adhesion. However, we could not attribute changes to specific cell types or biological pathways./p>

1 and false discovery rate (FDR)-adjusted p-value < 0.05). Briefly, small RNA-seq reads had adapter sequences trimmed with the BBMap suite to keep reads with fewer than 23 nucleotides after trimming. Reads were aligned to the OviAri4 genome and Oar_v4.0 annotation using miRDeep2./p> 1, FDR-adjusted p-value < 0.05; Supplementary Data 1) for treatment – control within each tissue using DESeq2 (v 1.30.1)63. Shrunken log2FCs were calculated with “normal” shrinkage estimator. Mature sequences of DE novel miRNAs were used to identify known miRNA homologs based on sequence similarity in other species with “Single sequence search” function on miRBase (v22.1) with SSEARCH search method./p>

5 and UMAP_2 < 6. We measured pseudotime trajectories with Slingshot74, with stretch = 0 and extension = “n”. We used clusters 10, 2, and 15 as the start clusters for the cardiomyocyte, fibroblast, and endothelial clusters, respectively. First, we removed genes that were not designated with a gene symbol. We then used the tradeSeq75 package to estimate the minimum number of appropriate knots with the “evaluateK”75 function before fitting a negative-binomial general additive model (nb-GAM) for each gene with the “fitGAM”75 function. The 5,000 most variable genes also had nb-GAM’s fitted in each condition to allow for differences in expression between conditions along pseudotime. We identified genes whose expression is associated with pseudotime using the “associationTest” function75, and genes that were differentially expressed between conditions using the “conditionTest”. We corrected p-values returned with these functions using a false-discovery rate (cut-off: FDR-adjusted p-value < 0.05). We then generated pseudotime heatmaps of associated and differentially expressed genes by predicting smoothers for each gene using the “predictSmooth”75 function. Smoothers were scaled and then plotted with the pheatmap function. We completed pathway enrichment of these associated and differentially expressed genes using the following command:76 gprofiler(genes,”hsapiens”, ordered = TRUE, src_filter = c(“GO:BP”, “REAC”, “KEGG”), custom_bg = detected_genes, correction_method = “fdr”)77 and plotted with ggplot2./p>